15.3 Directed evolution, DE

返回总讲义：CHEM10712 slides 知识点整理与讲解
知识点索引：CHEM10712 知识点索引
上级章节：15. Molecular evolution、ALE 与 directed evolution
导航：上一节：15.2 Adaptive Laboratory Evolution, ALE；下一节：15.4 Directed evolution case: sitagliptin transaminase

详细内容

DE 更直接针对 protein function。

基本循环：

library generation：mutagenesis/recombination 产生 gene variants。
expression：gene library 变成 protein/product library。
screening/selection：找有目标功能的 variants。
genotype-phenotype linkage：确保能从功能回到对应 gene。
repeat：多轮迭代 climbing fitness landscape。

Fitness landscape：

有 local maxima 和 global maxima。
小范围 mutagenesis 可能困在 local maximum。
需要足够 diversity 或 recombination 才能跨过 fitness valleys。

Screening methods：

colonies on solid media。
wells in liquid culture。
fluorescence/colorimetric reporters。
chromatography, mass spectrometry, NMR。
FACS 可按 fluorescence 分选 individual cells。

深入讲解

directed evolution 针对 gene/protein function 做人工 Darwinian cycle。library generation 提供 variation；screening/selection 提供 selection；保留 hit 并再次 mutagenesis 提供 iteration。

关键技术难点是 genotype-phenotype linkage。如果你筛到一个高活性蛋白，却无法知道对应 DNA sequence，就不能进入下一轮。phage display、cell display、microplate screening 等方法都在维护这个 linkage。

原文小点逐条解释

原文小点： 有 local maxima 和 global maxima。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。
原文小点： 小范围 mutagenesis 可能困在 local maximum。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。
原文小点： 需要足够 diversity 或 recombination 才能跨过 fitness valleys。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。
原文小点： colonies on solid media。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。
原文小点： wells in liquid culture。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。
原文小点： fluorescence/colorimetric reporters。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。
原文小点： chromatography, mass spectrometry, NMR。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。
原文小点： FACS 可按 fluorescence 分选 individual cells。
- 讲解： 这个小点属于 directed evolution cycle；要联系 library generation、genotype-phenotype linkage、screen/selection 和 iterative improvement。

做题和复习时怎么用

比较 ALE 和 DE：ALE selects organism fitness in environment; DE mutates genes/proteins and screens/selects desired molecular function.

常见误区

把工程化写成单一步骤，忽略 selection/screening、flux 和 host fitness。
混淆 ALE 的 whole-cell selection 与 directed evolution 的 protein-function screening。