CHEM10712 slides 知识点整理与讲解

来源范围：本讲义基于 slides/ 文件夹中实际存在的 PPTX/PDF/DOCX 课件与 workshop 文件整理。PP_CHEM10712/ 中的 mock exam/past paper 文件未作为主要知识来源。文件夹中没有单独的 Lecture 6、18、20、24 课件；这些内容只按已有 overview/workshop 中出现的部分整理。

Obsidian 版：二级章节与三级知识点标题已链接到独立笔记；总索引见 CHEM10712 知识点索引。

0. 课程总图：为什么这些知识点连在一起

CHEM10712 的核心问题是：如何从分子结构理解生命系统的功能，并进一步工程化生命系统。课程可以压缩成一条逻辑链：

1. 生命不是由很多神秘元素组成，而主要由 C、H、O、N、P、S 和少量金属/离子组成。
2. 少数小分子单元组合成四大类生物分子：蛋白质、核酸、糖、脂质。
3. 水环境决定了这些分子的相互作用方式：氢键、酸碱平衡、疏水效应、膜自组装。
4. 结构决定功能：一级序列影响三维结构；三维结构决定结合、催化、调控、稳定性。
5. DNA 信息流控制蛋白质生产：DNA -> RNA -> protein，并通过调控和突变改变功能。
6. 现代生物技术利用这些原理做 recombinant protein、CRISPR、metabolic engineering、directed evolution。

考试时不要把每个 lecture 当成孤立事实背诵。更高效的理解方式是：每遇到一个生物分子，问四个问题：

• 它由什么 building blocks 组成？
• 在水中是什么结构/电荷/构象？
• 它靠什么相互作用实现功能？
• 如何通过突变、条件改变或工程化改变它的功能？

1. 生命的分子基础与细胞作为 building block

1.1 Biological chemistry 的对象

Biological chemistry 研究生命的分子层面：蛋白质、核酸、糖、脂质、代谢物、膜、细胞器、反应网络。它服务于 biocatalysis、drug design、toxicology、pharmacology、medicine、cell factory 和 synthetic biology。

关键认识：

• 人体有大量细胞和蛋白，但底层化学原则相对统一。
• 生命分子的多样性主要来自组合复杂度，而不是元素种类复杂。
• LUCA, last universal common ancestor, 解释了为什么不同生命共享 DNA 信息储存、蛋白质、ATP、核心代谢网络等原则。

1.2 生命需要什么

slides 中反复出现的“recipe for life”可以整理为：

1. 少数化学元素形成基本 building blocks。
2. building blocks 聚合成多样的 polymers。
3. polymers 中出现 replication、variation、selection。
4. 自复制系统被膜包裹，形成早期细胞。
5. 由简单 prokaryotic cells 发展到更复杂的 eukaryotic cells。

进化所需的三个条件：

• variation：有差异，例如随机聚合或复制错误产生不同序列。
• selection：某些分子因结合、催化或稳定性更好被选择。
• replication：被选择的分子能被复制，且复制中可继续产生 variation。

这也是 directed evolution 的理论基础：人工制造多样性，筛选更好功能，再迭代。

1.3 Prokaryotes原核生物 与 eukaryotes真核生物

Prokaryotes原核生物：

• 结构相对简单，没有 nucleus。
• 常为单细胞。
• 生长快、易转化、常用于 cloning、protein expression、directed evolution。

Eukaryotes真核生物：

• 有 nucleus 和 organelles细胞器。
• 内部 compartmentalization 明显。
• mitochondria线粒体 和 chloroplasts叶绿体 可由 endosymbiosis内共生 理解。

Endosymbiont theory 内共生理论的证据：

• mitochondria/chloroplasts 有双层膜。
• 有自己的 circular DNA 和 ribosomes核糖体。
• 与现代 bacteria 有相似性。
• 解释 eukaryotic cells 如何获得高效 respiration/photosynthesis 呼吸作用/光合作用能力。

2. 水、pH、pKa 与生物分子的电荷状态

2.1 为什么“biochemistry is aqueous chemistry”

水是生命环境的主要溶剂。E. coli 等细胞中水占很高比例。水的关键性质：

• O 原子近似 sp3，O-H 键强极化。
• 水分子形成强 H-bond network。
• 液态水仍高度氢键化。
• 水能很好溶解 polar/hydrophilic solutes。

非极性分子不易溶于水，不只是因为“水不喜欢油”，更重要是 entropy：

• non-polar solute 周围的水被迫形成较有序的 cage 笼子。
• 多个疏水分子聚集时，受限制的水减少。
• 因此 hydrophobic compounds coalesce 疏水化合物聚结是熵驱动的。

Amphiphilic molecules 两亲性分子同时有 hydrophilic head 和 hydrophobic tail，会在水中自组装，例如 micelles微乳液、bilayers、membranes膜。

2.2 Proton transfer 与 Grotthuss mechanism 质子转移与格罗图斯机理

H3O+ 和 OH- 在水中移动异常快，因为 proton 可以通过氢键网络“跳跃”，不需要一个完整离子慢慢扩散。这就是 Grotthuss mechanism。

结论：

• acid-base reactions 在水中通常很快。
• ==proton transfer 是大量酶反应和生物反应的核心步骤==。

2.3 pH、pKa 与 Henderson-Hasselbalch

弱酸：

HA <=> H+ + A-
Ka = [H+][A-]/[HA]
pH = pKa + log([A-]/[HA])

必须会用的判断：

• ==pH = pKa 时，[A-] = [HA]，即 50% 去质子化，50% 质子化。==
• ==pH 比 pKa 高 1，base/acid = 10。==
• ==pH 比 pKa 高 2，base/acid = 100。==
• ==pH 低于 pKa，质子化形式更多。==

例如 workshop 中 Tyr side chain pKa = 10，在 pH 12：

log([Y-]/[YH]) = 12 - 10 = 2
[Y-]/[YH] = 100

所以 Tyr >99% 去质子化。

2.4 Buffer

==buffer 在 pH 接近 pKa 时最有效，因为酸和共轭碱浓度相近，能吸收加入的 H+ 或 OH-。==

phosphate buffer 例子：

• H2PO4-/HPO4^2- 的 pKa 约 6.8。
• pH 6.8 时二者各约 0.05 M，如果总浓度 0.1 M。
• 升到 pH 7.8 时，base/acid = 10，HPO4^2- 约 0.091 M，需要加入约 0.041 M NaOH。
• 再升到 pH 8.8 时，HPO4^2- 约 0.099 M，只需再加约 0.008 M NaOH。

==这说明：buffer capacity 在 pH = pKa 附近最大，离 pKa 越远越弱。==

2.5 Protein environment 会改变 pKa

课件特别强调：textbook pKa 只是 free amino acid 的参考值，protein fold 中的局部环境会显著改变 pKa。

规则：

• ==若去质子化后的 charged base 被稳定，pKa 降低。==
• ==若质子化后的 charged acid 被稳定，pKa 升高。==
• ==apolar environment 不利于带电形式，可能使酸更难去质子化，或使碱更容易失去质子。==
• ==salt bridge 盐桥能稳定带电形式。==
• ==同号电荷相近会 destabilize 带电形式。==

Asp 例子：

• Asp carboxylate 若被 Lys salt bridge 稳定，去质子化形式稳定 Asp⁻ 和 Lys⁺，pKa 低。
• 在 polar/water-like environment 中接近正常。
• 在 apolar environment 中 carboxylate 不稳定，pKa 高。

Lys 例子：

• Lys-NH3+ 若与 Asp salt bridge 形成，质子化形式稳定，pKa 高。
• apolar environment 或附近正电荷会使 Lys-NH3+ 不稳定，pKa 低。

3. 氨基酸、肽与蛋白质化学

3.1 alpha-amino acids （α-氨基酸） 与 chirality 手性

Proteinogenic amino acids 蛋白质组成氨基酸是 alpha-amino acids。在 pH 7 附近通常以 zwitterion 内盐形式存在：

• ==amino group 通常带正电。==
• ==carboxylate 通常带负电。==
• 氨基（–NH2）在 α 碳上
• 羧基（–COOH）在 α 碳上

==除 glycine 甘氨酸外，alpha carbon 有 stereocentre。天然蛋白几乎只用 L-amino acids。多数 L-amino acids 对应 S configuration （R/S的S），但 cysteine 半胱氨酸 因优先级不同是R，是例外。==

3.2 Peptide bond 肽键与方向性

两个氨基酸形成 ==peptide bond 是 dehydration/amide bond formation 脱水/酰胺键==的形成。==在水中并非自发容易发生，需要生物体系活化和酶促。==

多肽写法约定：

• ==从 N-terminus 写到 C-terminus。==
• ==一条 polypeptide 只有一个 free N-terminus 和一个 free C-terminus，除非被修饰。==
• ==side chains 的电荷由 pH、pKa 和局部环境决定。==

组合复杂度：

• 若每个位置有 20 种氨基酸，长度 N 的多肽理论上有 20^N 种。
• 10 个氨基酸的精确序列，如 ELVISLIVES，随机出现概率是 1/20^10。
• 平均蛋白约数百个氨基酸，组合复杂度极大。

3.3 20 种氨基酸的功能分组

Aliphatic/non-reactive 脂肪族/非反应性：

• Gly, Ala, Val, Leu, Ile。
• 多为 hydrophobic，不太参与反应化学。

Hydrophobic/nonpolar 疏水/非极性：

• Met, Pro, Phe, Trp。
• Met 有 thioether 但反应性不高。
• Pro 是 secondary amine，会强烈影响 backbone conformation。
• Trp 体积大且稀有，有 intrinsic fluorescence。

Polar/reactive 极性/反应性：

• Ser, Thr：alcohol。
• Asn, Gln：amide。
• Tyr：phenol，强碱条件可形成 phenolate。
• Cys：thiol，pKa 约 8.4，接近中性 pH，容易形成 thiolate，是强 nucleophile。

Charged/reactive 带电/活性：

• Asp, Glu：carboxylates，常作 acid/base 或 electrostatic groups。
• Lys, Arg：basic side chains。
• His：imidazole，pKa 接近生理 pH，能在质子化/中性之间切换，常用于 acid-base catalysis。

考试重点不是背所有分类表，而是知道哪些 side chains 能做化学：

• acid-base chemistry：Asp/Glu, His, Cys, Lys，有时 Tyr/Arg。
• nucleophiles：Cys, Lys, Tyr, His, Asp/Glu。
• redox：天然氨基酸中主要是 Cys。
• electrophiles 和强 redox chemistry 通常需要 cofactors 或 metal ions。

3.4 Lys, Cys, Trp 的代表性反应

Lysine：

• epsilon-amino group 可与 aldehydes 形成 imine/Schiff base。
• formaldehyde 可通过 Lys-Lys crosslink 固定生物组织。
• 在酶中，Lys 与 carbonyl 形成 Schiff base 后，可降低 alpha C-H 的 pKa，帮助形成 carbanion/enamine/enol 类中间体。

Cysteine：

• Cys-SH 可氧化形成 disulfide bond，两个 Cys 形成 cystine。
• Cys thiolate 在 pH 7 附近可存在，反应性强。
• iodoacetamide 等 alkylating agents 常优先修饰 Cys。
• 修饰后的 Cys 不能再形成 cystine/disulfide bridge。

Tryptophan：

• Trp 有 intrinsic fluorescence。
• fluorescence 对局部环境敏感，可报告 protein folding、ligand binding、conformational change。

3.5 Post-translational modification 与非蛋白氨基酸

蛋白质的化学能力可通过 post-translational modifications 扩展，例如：

• phosphorylation。
• methylation。
• acetylation。
• hydroxylation。
• carboxylation。

课件也提醒有 non-proteinogenic amino acids，它们可作为 signaling molecules、metabolic intermediates 或 cofactors 的组成部分。

4. 蛋白质折叠、稳定性、动力学与工程化

4.1 Anfinsen experiment

RNase A 变性/还原后，如果在去除 urea 的同时允许氧化形成 disulfide bonds，可以恢复活性。这说明 native state 信息编码在 amino acid sequence 中。

如果先在 denatured state 下随机氧化形成 disulfides，再去除 urea，活性只恢复很少，因为 disulfide pairing 被打乱。

加入少量 thiol 后能重新交换 disulfides 并恢复活性，说明正确 native state 在这些条件下是最稳定构象。

核心结论：

• sequence contains folding information。
• disulfide pairing 必须与 folding pathway 配合。
• native state 常是热力学稳定态，但细胞环境中也可能是 kinetic/metastable state。

4.2 Levinthal paradox 与 folding landscape

如果蛋白随机搜索所有 backbone 构象，折叠时间会极长。但真实蛋白可在秒或更快尺度折叠。

解决思路：

• folding 不是完全随机搜索。
• protein folding 沿着 energy landscape 发生。
• 可能有多个 folding pathways、intermediates 和 favored routes。

4.3 Misfolding 与 aggregation

蛋白可能 misfold，形成不同于 native state 的结构。常见结果：

• aggregation。
• amyloid fibrils。
• protein misfolding diseases。

在高蛋白浓度、crowded cell environment 或 denaturation 后，intermolecular contacts 可能使 aggregation 更有利，导致不可逆失活。

4.4 Chaperones 与 GroEL/GroES

若 native state 在细胞中只是 metastable，细胞需要 chaperones 帮助蛋白走向正确 folding route。

GroEL/GroES 的基本机制：

• 提供 folding chamber。
• 初始内壁偏 hydrophobic，可结合 unfolded/non-native protein。
• ATP hydrolysis 驱动 conformational change，使内壁更 hydrophilic。
• 隔离其他蛋白，减少 aggregation，促进 folding。

4.5 Tm、稳定性与溶液条件

Tm 是衡量 folded/native state 相对稳定性的常用指标。可用 fluorescence dye 监测：

• unfolded protein 暴露 hydrophobic pockets。
• dye 结合后 fluorescence 增强。
• 随温度升高得到 melting transition。

影响 Tm 的因素：

• temperature。
• pH。
• ionic strength。
• salt type。
• co-solutes，如 glycerol、urea。

Thermophilic proteins 通常更稳定。比较 psychrophilic、mesophilic、thermophilic homologs 可得到稳定性规律：

• hydrophobic core packing 更好。
• 更多 long-range contacts。
• 更多 disulfide bonds。
• 更少 Gly、更多 Pro。
• 更多 intramolecular ionic interactions。

4.6 Disulfide bonds 为什么稳定蛋白

disulfide bond 的稳定作用不只是多了一根 covalent bond，更重要是降低 unfolded state 的 conformational entropy。

规则：

• Cys 在序列上相距越远，但三维结构中越近，形成 disulfide 后对 unfolded chain 的限制越大。
• 长程 disulfide 更能降低 unfolded state 的自由度，因此稳定性提升更明显。
• extracellular proteins 常富含 disulfides，因为胞外环境更 oxidising、pH/盐/温度更变化。

4.7 稳定性与活性的 trade-off

不是所有蛋白越稳定越好。功能通常需要 dynamics：

• ligand binding 需要构象调整。
• catalysis 需要 active-site motion。
• allostery 需要远程 conformational changes。

增强 rigidity/stability 可能降低低温活性。这就是 stability-activity trade-off。

5. Coiled-coil 与 protein-ligand binding

5.1 Coiled-coil 的 heptad repeat

coiled-coil 常由 heptapeptide motif abcdefg 重复形成。由于 alpha helix 每圈约 3.5 个 residues，7 个 residues 约对应两圈，因此 a/d 位点可周期性朝同一侧形成 hydrophobic interface。

常见规律：

• a 和 d 位点常为 hydrophobic residues。
• e/g 位点常参与 charged/polar interactions，帮助决定 parallel 或 anti-parallel directionality。
• coiled-coil 例子包括 keratin、leucine zipper、tropomyosin/actin complex。

工程化思路：

• 设计 hydrophobic interface 让两条 helix 配对。
• 用 charged residues 设计方向性。
• 加入 Cys 形成 disulfide bond 可提高 thermostability。
• 也可通过改变 buffer、salt、co-solute 等非序列方式稳定。

5.2 Kd 与 ligand binding

基本平衡：

P + L <=> PL
Kd = [P][L]/[PL]

理解：

• Kd 越小，binding 越强。
• 当 free ligand concentration = Kd 时，理想情况下约 50% protein bound。
• 若 ligand 远大于 protein，可近似 fractional binding = [L]/(Kd + [L])。
• 要达到 90% bound，在 free ligand 近似条件下需 [L]free = 9Kd。

但 workshop 特别提醒：当 protein concentration 不可忽略时，不能只用 total ligand = 9Kd；还要补足被 protein 结合掉的 ligand。

6. 糖：monosaccharides、rings、glycosidic bonds 与 reducing sugars

6.1 Carbohydrates/saccharides 的定义与分类

Saccharides 是最丰富的生物分子之一，近似公式为 (CH2O)n, n >= 3。

按聚合程度：

• monosaccharides：单糖，monomers。
• oligosaccharides：短糖链，常接在 proteins/lipids 上，形成 glycoproteins/glycolipids。
• polysaccharides：长糖链，可非常大，例如 cellulose、starch、glycogen。

糖的功能：

• energy storage：starch in plants, glycogen in animals。
• structural：cellulose。
• recognition/regulation：glycoproteins/glycolipids 的 sugar head groups。
• metabolism：glucose 是重要 energy source。

6.2 Monosaccharide classification

按 carbonyl：

• aldose：含 aldehyde，如 glucose。
• ketose：含 ketone，如 ribulose、fructose。

按碳数：

• triose, tetrose, pentose, hexose, heptose。

组合命名：

• glucose = aldohexose。
• ribulose = ketopentose。

6.3 Chirality, D/L 与 stereoisomers

糖有多个 chiral centres，因此 stereoisomers 很多。

课件公式：

• n-carbon ketoses 有 2^(n-3) 个 stereoisomers。
• n-carbon aldoses 有 2^(n-2) 个 stereoisomers。

D/L 判断：

• 看离 carbonyl 最远的 chiral centre。
• 与 D-glyceraldehyde 绝对构型相同的是 D sugar，反之是 L sugar。

生物中 D sugars 比 L sugars 丰富；这与蛋白中 L-amino acids 丰富相呼应。

Epimers：

• 只在一个 chiral carbon 上构型不同的 diastereomers。
• 例如 glucose 与 mannose 是常见 epimer 关系。

6.4 Ring formation, Haworth, anomers

糖的 aldehyde/ketone 可与同一分子内的 alcohol 形成 hemiacetal/hemiketal，导致 cyclisation。

环大小：

• 6-membered ring = pyranose。
• 5-membered ring = furanose。

Haworth projection 是画糖环的常用方式，比 chair/boat 更方便。

Anomeric carbon：

• aldose 中通常是 C1。
• ketose 中常是原 carbonyl carbon，如 fructose 的 C2。

Anomers：

• alpha/beta anomers 是 anomeric carbon 构型不同的 diastereomers。
• 对 D sugars，alpha anomer 的 anomeric OH 与 CH2OH 在环的 opposite side；beta 在 same side。

6.5 Mutarotation 与构象稳定性

水中 glucose 线性形式很少，cyclic forms 占主要比例。alpha 和 beta anomers 可通过 linear form 互相转化，称为 mutarotation。

要点：

• mutarotation 经 linear form。
• acid/base catalysed。
• chair forms 通常比 boat forms 稳定。
• bulky substituents 倾向 equatorial positions。
• 不同 monosaccharides 的 anomer 稳定性不同。

6.6 Glycosidic bonds 与 reducing sugars

Glycosidic bond：

• carbohydrate 与另一基团通过 condensation reaction 形成的键。
• O-glycosidic bonds 在 polysaccharides 中类似 peptide bonds 在 proteins 中的作用。
• glycosidic bonds 相对稳定，不能 mutarotate。
• hydrolysis 由 sugar-selective glycosidases 催化。

Disaccharide 命名例子：

• sucrose：O-alpha-D-glucopyranosyl-(1 -> 2)-beta-D-fructofuranoside。
• (1 -> 2) 表示 glucose C1 与 fructose C2 连接。
• 也可有 (1 -> 4) 如 lactose，(1 -> 6) 如 isomaltose。

Reducing sugar：

• 有 free anomeric carbon，能经 linear form 暴露 aldehyde/ketone，因而可被 mild oxidation。
• lactose 是 reducing sugar。
• sucrose 的两个 anomeric carbons 都参与 glycosidic bond，因此不是 reducing sugar。

氧化：

• aldose 的 aldehyde 轻度氧化 -> aldonic acid。
• primary alcohol 氧化 -> uronic acid。
• uronic acids 可形成 lactones。

7. Lipids 与 membranes

7.1 Lipid 的定义

Lipids 是 soluble in organic solvents but sparingly soluble in water 的 biomolecules。

包括：

• fatty acids。
• triacylglycerols。
• glycerophospholipids。
• sphingolipids。
• glycolipids。
• steroids。
• some vitamins/hormones。
• non-protein membrane components。

7.2 Fatty acids

Fatty acids 是带 long-chain hydrocarbon sidechain 的 carboxylic acids。性质取决于：

• chain length。
• degree of unsaturation。
• double bond position。
• cis/trans isomerism。

关键规律：

• 自然界 double bonds 多为 cis。
• cis double bonds 造成 chain kink，降低 packing 和 van der Waals interactions。
• 因此 unsaturation 通常降低 melting point。
• 自然中 fatty acids 多以 esterified form 存在，而不是 free carboxylate。

命名：

• 例如 oleic acid = 18:1n-9 或 omega-9。
• 18 表示 18 carbons。
• 1 表示一个 double bond。
• n-9/omega-9 表示从 omega end 算，最后一个 double-bonded carbon 的位置。

Polyunsaturated fatty acids 常见 1-in-3 arrangement，通常不 conjugated：

• linoleic acid: 18:2n-6。
• alpha-linolenic acid: 18:3n-3。

7.3 Triacylglycerols

Triacylglycerols/triglycerides 是 glycerol 的 fatty acid triesters。

• simple triacylglycerols：三个 R groups 相同。
• mixed triacylglycerols：两个或三个不同 fatty acid residues。

Fats vs oils：

• fats 室温固体，通常较 saturated。
• oils 室温液体，通常较 unsaturated。
• plant oils 通常比 animal fats 含更多 unsaturated fatty acids。

7.4 Membrane lipids

Glycerophospholipids：

• biological membranes 的主要 lipid components。
• 基本骨架是 sn-glycerol-3-phosphate。
• R1/R2 是 fatty acids。
• X 是 polar head group。
• amphiphilic，因此能形成 bilayers。

Sphingolipids：

• 来自 sphingosine/dihydrosphingosine 等 amino alcohols。
• fatty acid 通过 amide bond 连接，而不是 glycerolipid 中常见 ester。
• 也是 membranes 的重要组分。

Glycolipids：

• carbohydrate 通过 glycosidic covalent bond 接在 lipid 上。
• 不限于 sphingolipids，也可有 glycoglycerolipids。
• sugar head groups 常参与 cell-surface recognition/regulation。

Gangliosides：

• 复杂 sphingoglycolipids。
• oligosaccharide head group 中含至少一个 sialic acid。
• 在 cell surface membranes 和 brain lipids 中重要。

7.5 Steroids 与 cholesterol

Steroids 源于 cyclopentanoperhydrophenanthrene skeleton。

Cholesterol：

• animal plasma membranes 的主要成分。
• 因 OH group 而 weakly amphiphilic。
• 可调节 membrane properties。
• 是 steroid hormones 的 precursor。

Steroid hormones 例子：

• estradiol/estrogens。
• testosterone。
• anabolic steroid medications。

7.6 Membrane permeability

Cell membranes 是 selective barrier。

可较容易通过：

• gases: O2, CO2, N2。
• 一些 small uncharged polar molecules，如 water、urea、ethanol，部分或完全可通过。

通常不能直接通过：

• large uncharged polar molecules，如 glucose/fructose。
• ions，如 K+, Na+, Cl-, HCO3-。
• charged polar molecules，如 ATP、amino acids、G6P。

因此细胞需要 membrane proteins：

• passive pores/channels。
• active transporters。

膜性质由 lipid composition 决定，包括 fluidity、curvature、melting/transition temperature。

8. 酶：specificity、cofactors、allostery 与 kinetics

8.1 Enzyme 是 macromolecular biological catalyst

与普通催化剂相比，酶通常有：

• higher reaction rate。
• mild conditions：aqueous solution、near-neutral pH、ambient temperature/pressure。
• high specificity：substrate/product stereospecificity、regiospecificity、limited side products。
• capacity for control：allosteric control、covalent modification、expression/degradation control。

酶反应基本写法：

E + S -> E + P

但更真实模型包括 enzyme-substrate complex、intermediates、product dissociation 等步骤。

8.2 Active site interactions 与 stereospecificity

substrate-active site interactions 可包括：

• van der Waals。
• hydrophobic interactions。
• electrostatic interactions。
• H-bonding。
• 有时形成 covalent enzyme-substrate intermediate。

因为 enzymes 本身由 chiral amino acids 构成，active sites 是 asymmetric 的，所以可选择性结合 stereoisomers，并产生 stereospecific products。

YADH, yeast alcohol dehydrogenase：

• 催化 alcohol 与 NAD+ 之间的 hydride transfer。
• NADH/NADPH 是生物中主要 hydride donors。
• NAD+/NADP+ 是对应 hydride acceptors。
• YADH 中 hydride transfer 的面选择性由 active site geometry 决定。

8.3 Cofactors/coenzymes 为什么重要

天然 amino acids 的反应性有限：

• 缺少强 electrophiles。
• redox chemistry 基本只靠 Cys 不够。

因此许多 enzymes 使用 cofactors/coenzymes/metal ions 扩展化学能力。例如：

• NAD(P)+/NAD(P)H：hydride transfer。
• FAD：redox chemistry。
• coenzyme B12。
• Zn in YADH。

8.4 Enzyme control 与 ATCase

反应速率可通过以下方式控制：

• enzyme concentration。
• substrate concentration，特别在 [S] < Km 时。
• active enzyme fraction。
• enzyme/cofactor synthesis or degradation。
• allosteric conformational control。

ATCase, aspartate transcarbamoylase：

• 催化 pyrimidine biosynthesis 的第一步特异反应。
• 有 cooperative substrate binding。
• 受 CTP feedback inhibition。
• 受 ATP activation。
• 目的：平衡 ATP:CTP。

Allostery：

• enzyme 有 active R state 和 inactive T state。
• activator preferentially binds R state。
• inhibitor preferentially binds T state。
• allosteric ligand 通常不结合 active site，而结合 separate binding site。

8.5 Michaelis-Menten kinetics

模型：

E + S <=> ES -> E + P

常数：

• k1/kf：substrate binding，second-order。
• k-1/kr：substrate dissociation，first-order。
• k2/kcat：chemical step，first-order。

核心公式：

v = kcat [E]T [S] / (Km + [S])
Vmax = kcat [E]T

参数理解：

• v：reaction velocity，product formation 或 substrate consumption rate。
• kcat：turnover number，每个 enzyme active site 每秒生成多少 product。
• Km：当 v = Vmax/2 时的 [S]；常被粗略视作 substrate affinity 指标，但严格上取决于机制。
• kcat/Km：catalytic efficiency，尤其适合比较低 [S] 下的酶表现。

MM model 假设/限制：

• single substrate。
• steady state。
• free ligand approximation: [S] ~ [S]0。
• 无 allosterism。
• 单一 irreversible chemical step。
• 不考虑复杂 intermediates/EP complex。

8.6 如何从 MM plot 读参数

从 saturation curve：

• plateau 给 Vmax。
• Vmax 除以 [E]T 得 kcat。
• v = Vmax/2 时对应的 [S] 是 Km。

课件例子：

• enzyme A: kcat = 10 s^-1, Km = 10 uM，kcat/Km = 1.0 uM^-1 s^-1。
• enzyme B: kcat = 3 s^-1, Km = 2 uM，kcat/Km = 1.5 uM^-1 s^-1。
• 若以 catalytic efficiency 比较，B 更好。

Workshop 例子：

• condition 1: kcat = 1000 s^-1, Km = 1 mM，kcat/Km = 1000 s^-1 mM^-1。
• condition 2: kcat = 30 s^-1, Km = 0.1 mM，kcat/Km = 300 s^-1 mM^-1。
• condition 1 的 catalytic efficiency 更高。

8.7 Competitive inhibition 与 TSAs

Competitive inhibitor：

• 与 substrate 竞争 active site。
• 通常结构类似 substrate，但不反应。
• high [S] 可部分克服 inhibition。
• Vmax 不变。
• apparent Km 增大。

Transition state analogues, TSAs：

• transition state 寿命极短，不能分离。
• TSA 是稳定分子，模仿 transition state 的结构或 charge distribution。
• 因酶本质上稳定 transition state，好的 TSA 可有很高 affinity。
• 可成为有效 drugs。

8.8 Enzyme catalysis 的本质

酶通过降低 activation free energy 加速反应。常用策略：

• substrate binding 和 proximity/orientation。
• acid-base catalysis。
• covalent catalysis。
• electrostatic stabilization。
• transition state stabilization。
• cofactor/metal-assisted catalysis。

考试中常要求用 arrow pushing 解释，例如 keto-enol tautomerisation。要答清：

• 哪个 residue 作 acid，哪个作 base。
• transition state/charge distribution 如何被 stabilised。
• mutation to Ala 会怎样影响 kcat 和 Km。

一般判断：

• 若 residue 直接参与催化，mutating to Ala 会显著降低 kcat。
• 若 residue 主要参与 binding，Km 更可能变大。
• 若 residue 同时参与 binding 和 catalysis，两者都可能受影响。

9. Metabolism 与 biocatalysis 在课件中的定位

文件夹中没有完整独立的 Hay Lecture 5/6 slides，但 syllabus、workshop 和 L22 中反复出现相关概念。

9.1 Metabolism 的核心理解

Metabolism 是大量 enzyme-catalysed reactions 的网络。

• catabolism：分解 nutrients，产生能量/还原力/precursors。
• anabolism：合成 biomolecules，需要 energy 和 building blocks。
• ATP 是普遍 energy currency。
• 代谢调控常发生在 thermodynamically favourable 或 pathway-committed steps。

Workshop 提到 glycolytic enzymes 的 thermodynamic properties，并要求判断哪些适合被 co-substrate/coenzyme availability 调控。答题思路：

• near-equilibrium steps 通常由 substrate/product concentrations 推动。
• far-from-equilibrium steps 更适合 regulation。
• 若反应依赖 ATP/NADH/NAD+/其他 cofactors，其 availability 可作为调控因素。

9.2 Biocatalysis 与 green chemistry

Biocatalysis 使用 enzymes 或 engineered cells 做化学转化。优势：

• 温和条件。
• 高 selectivity。
• 可减少 waste。
• 可在 aqueous/renewable feedstock 条件下工作。

限制：

• enzyme stability。
• substrate scope。
• product inhibition/toxicity。
• cofactor supply。
• scale-up 和 host engineering。

这为 L22/L23 的 metabolic engineering 和 directed evolution 铺垫。

10. Origins of life 与 evolutionary principles

10.1 Prebiotic chemistry

slides 提到 early Earth 可能有 reducing atmosphere、volcanic activity、water sources 等条件。Miller-Urey experiment 说明在模拟早期地球条件下可以 abiotic synthesis amino acids。

Tibor Ganti 的 Chemoton 思路：life requires:

• metabolism。
• self-replication。
• bilipid membrane。

这与课程前面的“细胞 = selective barrier + information/control + reaction network”相呼应。

10.2 RNA world hypothesis

RNA world hypothesis 的核心：

• 早期生命可能依赖 RNA 同时承担 information storage 和 catalysis。
• RNA 能形成复杂结构，且 ribozymes 能催化反应。
• 后来 DNA 更适合长期信息储存，proteins 更适合多样催化功能。

DNA/RNA/protein 的功能分工可以理解为演化后的专业化。

10.3 LUCA 与 common biochemistry

LUCA 的证据：

• shared genetic code。
• ribosomes。
• common metabolic pathways。
• membranes。
• ATP synthase。
• DNA/RNA/protein based information flow。

生命共享：

• DNA 作为遗传信息。
• 20 amino acids 组成 proteins。
• central dogma。
• ATP 和核心 metabolism。

10.4 Evolution mechanisms

分子层面的 evolution 来自 DNA sequence changes：

• point mutations。
• insertions/deletions。
• recombination。
• gene duplication/divergence。

突变可能改变：

• protein sequence。
• protein structure。
• catalytic/binding function。
• fitness。

Natural selection 会富集带来 fitness benefit 的 variants。

11. Nucleic acids、central dogma 与 genetic regulation

11.1 DNA 与 RNA 的区别

DNA：

• 由 2’-deoxyribose、phosphate、A/T/G/C bases 组成。
• 更稳定，适合 long-term information storage。
• duplex structure 较 rigid/conserved。
• DNA building blocks 是 dNTPs。

RNA：

• 由 ribose、phosphate、A/U/G/C bases 组成。
• 2’-OH 使 RNA 更易 chemical hydrolysis。
• 结构更 dynamic/varied。
• 可参与 catalysis，例如 ribozymes。
• RNA building blocks 是 NTPs。

课件列出的重点区别：

• RNA 是 ribonucleic acid，DNA 是 2’-deoxyribonucleic acid。
• RNA 用 U，DNA 用 T。
• DNA 常偏 C2’ endo sugar conformation，RNA 常偏 C3’ endo。
• DNA 更稳定，RNA 更 labile。
• DNA 更适合信息储存，RNA 更适合结构/催化/中介功能。

11.2 Base pairing

基本配对：

• A-T in DNA。
• A-U in RNA。
• G-C。

配对的本质是 H-bond donor/acceptor pattern 和几何互补。G-C 通常氢键更多，因此 GC-rich regions 往往 Tm 更高；这也是 primer Tm 粗略估算中 GC 给 4 度、AT 给 2 度的原因。

11.3 Central dogma

信息流：

DNA -> RNA -> Protein -> Metabolites/Function

Replication：

• DNA polymerase 复制 DNA。
• 使用 dNTPs。
• 读写方向涉及 5’->3’ linkage；nature read/writes from 5’ to 3’。

Transcription：

• RNA polymerase 从 DNA template 转录 RNA。
• 使用 NTPs。
• 由 promoter 和 transcription start site 控制。

Translation：

• ribosome 将 mRNA codons 翻译成 protein。
• tRNA 携带 amino acids。
• aminoacyl-tRNA 是 amino acid 与 tRNA 的连接形式。

Ribosome：

• E. coli ribosome 有 50S large subunit 和 30S small subunit。
• 包含 rRNAs 和 proteins。
• 有 A site, P site, E site。

11.4 Genetic code 与 mutations

Genetic code 把 codons 映射到 amino acids。DNA mutation 可导致：

• synonymous mutation：氨基酸不变。
• missense mutation：氨基酸改变。
• nonsense mutation：形成 stop codon。
• frameshift：reading frame 改变，影响更大。

课件中 L23 用序列变化展示：DNA 改变可影响 protein sequence，从而改变 protein function 和 fitness。

11.5 Gene features

一个 bacterial genetic unit 常见组成：

• promoter，包括 transcription start site。
• -35 和 -10 hex boxes，上游由 RNA polymerase 识别。
• +1 transcription start。
• ribosome binding site, RBS，通常位于 GOI 上游约 5-10 nt。
• start codon，常为 AUG。
• GOI, gene of interest/coding region。
• stop codon，例如 TAA。
• transcription terminator。

Transcription 发生在 promoter 开始；translation 从 RBS 定位 ribosome 后在 start codon 开始。

12. PCR、primer design 与 DNA manipulation

12.1 PCR 原理

PCR 用 primers 和 DNA polymerase 扩增目标 DNA。

基本循环：

1. Denaturation：双链 DNA 分开。
2. Annealing：primers 与 template 互补结合。
3. Extension：polymerase 从 primer 3’-OH 延伸新链。

12.2 Primer design 基本法

课件给出简化 Tm 公式：

Tm = 2 * (A + T) + 4 * (G + C)

primer 设计原则：

• forward primer 与目标序列 5’ 端相同方向，写 5’->3’。
• reverse primer 是目标 3’ 端互补链的 reverse complement，也写 5’->3’。
• 两个 primers 的 Tm 应接近。
• primer 需要能特异性夹住 target region。

课件例子：

pF: ATGGCCATGATTACGGATTCA
pR: TTATTTTTGACACCAGACCAAC
Tm approx. 60 C

常见错误：

• reverse primer 直接抄 template 末端而没有 reverse complement。
• 忘记所有 primers 都要按 5’->3’ 写。
• 只看序列长度不看 GC content。

12.3 DNA manipulation 概念

Lecture overview 中出现的 tools：

• restriction enzymes。
• ligases。
• plasmids。
• PCR/qPCR。
• electrophoresis。
• DNA reading/writing。

这些是 recombinant DNA 和 protein expression 的基础。

13. Recombinant proteins 与 genome editing

13.1 Applications

课件列出的应用：

• enzymes in washing powder。
• recombinant insulin。
• DNA arrays for cancer biomarkers。
• biosynthetic drug production，例如 artemisinin。
• biofuel production in engineered microorganisms。
• attenuated bacteria for vaccines。

13.2 Plasmids

Plasmid：

• small circular double-stranded DNA。
• 常见于 bacteria。
• 与 chromosomal DNA 分离。
• 可 independently replicate。
• 大小常约 1-10 kbp。

主要 features：

• ORI：origin of replication，允许 host 复制 plasmid。
• antibiotic selection marker，例如 amp resistance。
• GOI：gene of interest。
• promoter、RBS、terminator 等 expression/regulation elements。

13.3 E. coli transformation

流程：

1. Competent cell preparation：让细胞具备 uptake DNA 的能力。
2. Transformation：chemical heat shock 或 electroporation 形成暂时 pores。
3. Recovery：在无 antibiotics medium 中恢复膜和表达 resistance marker。
4. Selective plating：含 antibiotics 的 plate 上只有 carrying plasmid 的细胞生长。

为什么 E. coli 常用：

• transformation efficiency 高。
• 生长快。
• 操作便宜简单。
• 适合 cloning 和许多 bacterial protein expression。

限制：

• complex eukaryotic protein folding 可能不足。
• post-translational modifications 有限。
• disulfide-rich 或 glycosylated proteins 可能需要 yeast/insect/mammalian systems。

13.4 Expression hosts 比较

课件列出 bacteria、yeast、plant、insect、mammalian hosts 的 pros/cons。总体规律：

• bacteria：快、便宜、易操作，但 folding/PTM 能力有限。
• yeast：比 bacteria 更适合某些 eukaryotic proteins，但仍有限。
• insect/mammalian：更适合复杂蛋白、protein complexes、PTMs，但慢、贵、操作复杂。

13.5 CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 是 molecular scissors：

• guide RNA 识别 target DNA sequence。
• Cas9 protein 在特定位点切割 DNA。
• 后续 repair 可导致 knockout 或 precise editing。

应用：

• correct genetic defects。
• study gene function。
• disease models。
• crop/food/fermentation process engineering。
• potential therapeutics for cancer, HIV, genetic disorders。

伦理问题：

• germline editing 可遗传。
• eugenics 风险。
• misuse。
• access inequality。

14. Microbial metabolic engineering 与 case studies

14.1 Metabolic engineering 策略

目标：把微生物变成生产 high-value products 的 cell factories。

常用策略：

• overexpress key metabolic enzymes。
• delete competing pathways。
• increase precursor supply。
• balance redox and energy cofactors。
• optimize pathway of interest。
• maintain cellular homeostasis and robust production phenotype。

Feedstocks：

• lignocellulosic biomass。
• C1 compounds，如 methanol、formate、CO2。
• organic waste。

Products：

• plant natural products。
• bioplastics。
• biofuels。
• pharmaceuticals。
• colourants。
• aromatics。

14.2 C1 feedstocks 与 engineered E. coli

C1 compounds 便宜且来源广，可来自 fossil fuel、industrial by-products、biomass。Synthetic biology、genome engineering、laboratory evolution 可将 C1-based cell factories 用于 high-value products。

课件例子：

• engineered E. coli 通过 heterologous expression of RuBisCO, Prk, CA, Fdh 构建 synthetic CBB cycle。
• formate 提供 reducing power。
• deletion of pfk and zwf 使 growth 依赖 RuBisCO carboxylation。
• 结合 ALE 逐步减少外加 xylose，实现 CO2-based growth。

14.3 Nanobodies

Antibodies 识别 antigens，可用于 diagnostics/therapeutics。

Human mAb：

• 有 Fc region 和 Fab region。
• variable Fab 包含 heavy chain 和 light chain。

Camelid heavy-chain antibodies：

• 更简单，只含 heavy chain。
• Nanobodies 是短的 single-domain antibody fragments。

Nanobody 优势：

• smaller size。
• higher stability。
• easier genetic manipulation。
• 可用于 therapeutic、diagnostic、biosensor 等。

Phage display approach：

• camelids immunized 或使用 naive/synthetic library。
• 提取 lymphocytes/mRNA。
• PCR 获得 Nb sequences。
• transform into phage vectors/E. coli。
• biopanning 富集 high-affinity phages。
• phage-ELISA、sequencing、affinity testing。

14.4 Artemisinin production

Artemisinin：

• 抗疟疾 terpene-based molecule。
• 原本从 Artemisia annua 提取。

Metabolic engineering 思路：

• 在 S. cerevisiae 中利用 FPP/terpene biosynthesis pathway 生产 artemisinic acid。
• overexpress pathway genes。
• repress competing squalene synthase ERG9。
• A. annua enzymes 将 amorphadiene 氧化到 artemisinic acid。
• 再 semi-synthesis 生成 artemisinin。

这展示了 synthetic biology + fermentation + chemistry 可以替代或补充植物提取。

15. Molecular evolution、ALE 与 directed evolution

15.1 DNA variation 如何影响 function

DNA sequence 变化可导致 protein sequence 变化。protein sequence 变化可能影响：

• folding。
• active site geometry。
• substrate binding。
• stability。
• expression。
• cellular fitness。

不是所有突变都有益：很多 neutral 或 deleterious。Selection 会富集在特定环境下有 fitness benefit 的 variants。

15.2 Adaptive Laboratory Evolution, ALE

ALE 模拟自然选择，但在实验室中控制环境。

流程：

1. Microbes 在目标环境中长期培养。
2. Natural selection 富集 improved fitness 的 mutant strains。
3. 测定 phenotype improvement。
4. DNA sequencing 找 adaptive mutations。

应用：

• growth rate optimization。
• stress tolerance，例如 pH、antibiotics、temperature。
• alternative substrate utilization。
• increased product yield/titer。
• general discovery of genetic/system-level mechanisms。

ALE 常用于 microbial metabolic engineering，因为可把目标功能与 growth benefit 连接。

15.3 Directed evolution, DE

DE 更直接针对 protein function。

基本循环：

1. library generation：mutagenesis/recombination 产生 gene variants。
2. expression：gene library 变成 protein/product library。
3. screening/selection：找有目标功能的 variants。
4. genotype-phenotype linkage：确保能从功能回到对应 gene。
5. repeat：多轮迭代 climbing fitness landscape。

Fitness landscape：

• 有 local maxima 和 global maxima。
• 小范围 mutagenesis 可能困在 local maximum。
• 需要足够 diversity 或 recombination 才能跨过 fitness valleys。

Screening methods：

• colonies on solid media。
• wells in liquid culture。
• fluorescence/colorimetric reporters。
• chromatography, mass spectrometry, NMR。
• FACS 可按 fluorescence 分选 individual cells。

15.4 Directed evolution case: sitagliptin transaminase

Transaminases：

• PLP-dependent enzymes。
• 将 prochiral ketones 转为 chiral amines。

课件例子：

• 从天然 enzyme 出发，它有合适反应性但不识别 prositagliptin substrate。
• 通过 computational modeling 和 substrate walking 得到弱活性 transaminase。
• 多轮 mutagenesis/screening 后 catalytic activity 提升约 25,000-fold。
• engineered transaminase 比 rhodium catalyst 更高 yield/stereoselectivity，并降低 waste/cost。

这连接了 enzyme specificity、stereochemistry、green chemistry、directed evolution。

15.5 Laboratory evolution 的应用清单

可用于：

• 提高 enzyme catalytic activity。
• 改善 substrate specificity。
• 提高 enantioselectivity/diastereoselectivity。
• 增加 protein thermal/pH/solvent stability。
• 发展 industrial biocatalysts。
• 优化 microbial pathways。
• 提高 stress tolerance。
• 扩展 substrate range。
• 从 biomass/waste/C1 compounds 做 sustainable biomanufacturing。
• drug discovery：antibodies、nanobodies、binding proteins、biosensors。
• 理解 structure-function relationships、fitness landscapes、epistasis。

16. 常见考试/答题模式

16.1 pKa/charge state 题

步骤：

1. 写出所有 ionisable groups。
2. 标出给定 pKa。
3. 用 pH 与 pKa 比较判断主要质子化状态。
4. 若要求比例，用 Henderson-Hasselbalch。
5. 若在 protein environment 中，判断 charged/protonated/deprotonated form 是否被稳定。

常见陷阱：

• 忽略 termini。
• 只用 textbook pKa，不考虑 salt bridge/apolar environment。
• 把 His、Cys 这类接近 physiological pH 的 residues 判断得过于绝对。

16.2 糖结构题

步骤：

1. 判断 aldose/ketose 和 carbon number。
2. 判断 D/L。
3. 从 Fischer 转 Haworth 时注意哪些 substituents 在上/下。
4. 标出 anomeric carbon。
5. 判断 alpha/beta。
6. 若形成 glycosidic bond，判断 anomeric carbon 是否 free，从而判断 reducing sugar。

16.3 脂质性质题

优先判断：

• chain length 越长，melting point 越高。
• cis double bonds 越多，packing 越差，melting point 越低。
• saturated fats 更可能固体，unsaturated oils 更可能液体。
• charged/large polar molecules 不能自由过膜。

16.4 Kd/MM kinetics 题

Kd：

• Kd = [P][L]/[PL]。
• Kd 小，binding 强。
• 90% bound 近似需要 [L]free = 9Kd，但 high [P] 时要考虑 mass balance。

MM：

• 读 Vmax plateau。
• Km 是 half-maximal velocity 对应的 [S]。
• kcat = Vmax/[E]T。
• 比较 enzyme efficiency 常用 kcat/Km。

16.5 Enzyme mechanism 题

答题结构：

1. 画 substrate/product/intermediate。
2. 指出 acid/base/nucleophile/electrophile。
3. 画或描述 transition state charge distribution。
4. 说明 enzyme 如何 stabilise transition state。
5. mutation to Ala 时区分 kcat 与 Km 的影响。
6. 若设计 TSA，说明它模仿了哪些 TS 特征、缺少哪些动态/反应特征。

16.6 PCR/primer 题

步骤：

1. 确认 target sequence 方向。
2. forward primer 取目标 5’ 端序列，写 5’->3’。
3. reverse primer 取目标 3’ 端的 reverse complement，写 5’->3’。
4. 用 Tm = 2(A+T)+4(G+C) 粗略估算。
5. 检查两个 primers Tm 是否相近。

16.7 Recombinant protein production 题

从 gene sequence 到 protein：

1. 设计/合成或 PCR amplify GOI。
2. clone into plasmid with ORI, selection marker, promoter, RBS, terminator。
3. transform host，例如 E. coli。
4. select transformants on antibiotics。
5. induce/express protein。
6. lyse cells 或收集分泌产物。
7. purify protein。
8. verify identity/activity。

16.8 Evolution/engineering 题

区分：

• natural evolution：环境中突变和选择长期发生。
• ALE：在实验室控制 microbial environment，让 selection 富集适应性突变。
• directed evolution：人工生成 gene/protein library，screen/select desired protein function。
• rational design：基于结构/机制直接设计突变，常与 DE 结合。

17. 一页总复习

必须熟练的公式：

pH = pKa + log([A-]/[HA])
Kd = [P][L]/[PL]
v = kcat [E]T [S] / (Km + [S])
Vmax = kcat [E]T
catalytic efficiency = kcat/Km
Primer Tm approx. = 2(A+T) + 4(G+C)

必须能解释的概念：

• hydrophobic effect 是 entropy-driven。
• buffer 在 pH = pKa 附近最有效。
• protein fold environment 可大幅改变 pKa。
• L-amino acids、D-sugars 的生物偏好。
• peptide/glycosidic/phosphodiester bonds 的方向性。
• anomer、mutarotation、reducing sugar。
• cis unsaturation 降低 fatty acid melting point。
• membrane selective permeability。
• enzyme specificity 来自 active site geometry。
• cofactors 扩展 amino acids 的有限反应性。
• allostery 通过 R/T states 改变活性。
• competitive inhibition：Vmax unchanged, apparent Km increased。
• DNA -> RNA -> protein 的分子参与者。
• PCR primers 必须写 5’->3’。
• plasmid features: ORI, marker, GOI/regulatory elements。
• CRISPR-Cas9 = guide RNA targeting + Cas9 cutting。
• ALE 作用于 whole organism fitness；DE 作用于 protein/gene function screening。

最重要的跨章节连接：

• 水环境决定 pH/pKa、疏水效应和 membrane formation。
• amino acid sequence 决定 folding，但 function 需要 dynamics。
• enzyme catalysis 依赖 protein structure、cofactors 和 transition state stabilization。
• DNA sequence 变化会影响 protein sequence/function，从而产生 evolution 或 engineering outcome。
• biotechnology 本质上是把 molecular biology、enzyme chemistry 和 evolution principles 组合使用。